Qualitätskontrolle meines tellmeGen-Genoms: Habe ich wirklich eine 30×-Sequenzierung erhalten?

Vor Kurzem habe ich mein eigenes Genom sequenzieren lassen – beim Direct-to-Consumer-Anbieter für Ganzgenomsequenzierung tellmeGen. Nachdem ich mein Genom heruntergeladen und die von tellmeGen bereitgestellten Auswertungen analysiert hatte, blieb für mich eine wichtige Frage offen: Wie gut war die eigentliche Sequenzierung?

tellmeGen stellte mir zwei große FASTQ-Dateien sowie eine VCF-Datei mit den identifizierten genetischen Varianten zur Verfügung, jedoch keinen detaillierten Qualitätsbericht zur Sequenzierung. Deshalb habe ich die Rohdaten selbst verarbeitet und unter anderem Qualität, Mapping, Duplikationsrate, Sequenziertiefe und mögliche Kontaminationen untersucht.

Das Ergebnis ist beruhigend: Meine Speichelprobe lieferte einen qualitativ hochwertigen menschlichen Ganzgenomdatensatz, und tellmeGen erreichte die beworbene durchschnittliche Sequenziertiefe von 30×. Ich fand keine Hinweise auf eine fehlerhafte Sequenzierbibliothek, eine zu geringe Sequenziermenge, eine relevante Kontamination durch nichtmenschliche DNA oder eine Verunreinigung mit DNA einer anderen Person.

Der vollständige anonymisierte MultiQC-Qualitätsbericht steht als interaktiver HTML-Report zur Verfügung.

Das Ergebnis auf einen Blick

Qualitätsmetrik	Ergebnis	Bedeutung	Bewertung
Sequenziermenge	720,0 Millionen Reads, 2 × 150 bp	Etwa 360 Millionen Read-Paare und 108 Milliarden sequenzierte Basen	Sehr gut
Basen mit mindestens Q30	94,5 %, etwa 102 Gb	Für den Großteil der Basen mindestens 99,9 % geschätzte Genauigkeit beim Base Calling	Hervorragend
Von fastp beibehaltene Reads	100 %	Kein relevanter Verlust durch Qualitäts- oder Längenfilterung	Hervorragend
GC-Gehalt	40,3 %	Passend für eine menschliche Ganzgenomsequenzierung	Gut
Gemappte Reads	99,2 %	Nahezu alle Reads ließen sich dem menschlichen Referenzgenom zuordnen	Hervorragend
Korrekt gepaarte Reads	96,1 %	Beide Enden wurden meist mit der erwarteten Orientierung und Distanz zueinander gemappt	Sehr gut
Picard-Duplikationsrate	1,1 %	Sehr wenig redundante Sequenzierung nach dem Alignment	Hervorragend
Mittlere Insert-Größe	286 bp	Normale Fragmentgröße für eine 2 × 150-bp-Short-Read-Bibliothek	Gut
Finale mediane Sequenziertiefe	36×	Die Hälfte der untersuchten Positionen war mit mindestens ungefähr dieser Tiefe abgedeckt	Über dem Zielwert
Geschätzte mittlere autosomale Sequenziertiefe	Etwa 34,4×	Nach Chromosomenlänge gewichteter Mittelwert über die Chromosomen 1–22	Über dem Zielwert
Genom mit mindestens 10× abgedeckt	94 %	Der Großteil der Referenzpositionen wurde durch zahlreiche Reads gestützt	Gut
Genom mit mindestens 20× abgedeckt	Etwa 87 %	Eine große Mehrheit der Positionen weist eine hohe Abdeckung auf	Gut
Genom mit mindestens 30× abgedeckt	73 %	Plausibel für ein Genom mit einer mittleren Tiefe im mittleren 30er-Bereich	Gut
VerifyBamID2 FREEMIX	0,000161754 bzw. 0,016 %	Kein relevanter Hinweis auf DNA einer anderen menschlichen Probe	Hervorragend
Indexcov-Abweichungen der Abdeckung	15,3 % der Bins außerhalb von 0,85–1,15	Gewisse regionale Unterschiede der Abdeckung, vor allem für Copy-Number-Analysen relevant	Kleine Einschränkung
Gesamtbewertung	Etwa 34–36× hochwertige menschliche WGS-Daten	Die beworbene durchschnittliche Sequenziertiefe von 30× wurde erreicht	Gut bis sehr gut

Die Messwerte in dieser Tabelle stammen aus den Auswertungen der Roh-FASTQ-Dateien, von fastp, dem Mark-Duplicate-BAM, dem final rekalibrierten BAM sowie von Mosdepth, indexcov und VerifyBamID2.

Reproduzierbarkeit der Analyse

Den Code, die Parameter und die verwendeten Cluster-Skripte habe ich in meinem öffentlichen Repository hinterlegt:

https://github.com/matmu/wgs

Für die Hauptanalyse habe ich Version 3.9.0 von nf-core/sarek verwendet. Sarek ist ein von der Community entwickelter Workflow zur Verarbeitung von Ganzgenom- und Exomsequenzierungsdaten. Der Workflow kann Rohdaten im FASTQ-Format einlesen, die Reads an ein Referenzgenom alignieren, duplizierte Fragmente markieren, Basenqualitäten rekalibrieren, verschiedene Arten genetischer Varianten identifizieren und annotieren sowie Qualitätsberichte erzeugen (Garcia, F1000Research, 2020).

Sarek basiert auf Nextflow. Anstatt die komplette Analyse in einem einzigen monolithischen Programm auszuführen, zerlegt Nextflow den Workflow in viele kleinere Arbeitsschritte. Diese können auf einer Workstation, einem Rechencluster oder in einer Cloud-Infrastruktur ausgeführt werden. Container sorgen dabei für konsistente Versionen der benötigten Software und erleichtern damit die Reproduzierbarkeit der Analyse.

Für das Alignment habe ich das menschliche Referenzgenom GRCh38 und BWA-MEM verwendet. Meine Konfiguration war relativ umfangreich und umfasste mehrere Caller für kleine Varianten, strukturelle Varianten und Copy-Number-Varianten sowie anschließend eine Annotation mit VEP und snpEff. Ein einfacherer Workflow mit nur einem Caller für kleine Varianten würde deutlich weniger Rechenressourcen benötigen.

Am Ende fasste Sarek die Qualitätsmetriken in MultiQC zusammen. MultiQC kombiniert die Ergebnisse zahlreicher bioinformatischer Programme in einem interaktiven Bericht und erleichtert es dadurch, technische Probleme zu erkennen und verschiedene Analyseschritte miteinander zu vergleichen (Ewels, Bioinformatics, 2016).

In meinem Bericht sind unter anderem folgende Tools enthalten:

• FastQC zur Untersuchung der Rohdaten aus der Sequenzierung.
• fastp zur Qualitätskontrolle und Filterung auf Read-Ebene (Chen, Bioinformatics, 2018).
• samtools zur Zusammenfassung der Alignment-Statistiken.
• Picard MarkDuplicates zur Bestimmung der alignierungsbasierten Duplikationsrate der Bibliothek.
• Mosdepth zur Berechnung der genomweiten Sequenziertiefe und der Verteilung der Abdeckung (Pedersen, Bioinformatics, 2018).
• indexcov zum schnellen Screening auf regionale Auffälligkeiten der Abdeckung und große Copy-Number-Veränderungen (Pedersen, GigaScience, 2017).

Wie viel Rechenleistung war erforderlich?

Die Analyse eines vollständigen Genoms benötigt deutlich mehr Speicherplatz, als die Größe der komprimierten FASTQ-Dateien zunächst vermuten lässt. Reads werden dekomprimiert, aligniert, sortiert, rekalibriert, in genomische Regionen aufgeteilt und von mehreren Variant Callern verarbeitet. Nextflow behält außerdem Zwischendateien bei, damit eine unterbrochene Analyse mit -resume fortgesetzt werden kann, anstatt komplett von vorne beginnen zu müssen.

Meine Analyse benötigte folgenden Speicherplatz:

Verzeichnis oder Datentyp	Belegter Speicher	Inhalt
Ursprüngliche komprimierte FASTQ-Dateien	Etwa 83 GB	Rohdaten der Paired-End-Sequenzierung
work/	793 GB	Nextflow-Zwischendateien, die zum Fortsetzen von Tasks benötigt werden
results/	401 GB	Finale Ergebnisse von Sarek und VerifyBamID2 einschließlich Archive
cache/	39 GB	Referenzdaten und Software-Container
Gesamt ungefähr	1,32 TB	Vollständiges Analyseverzeichnis zum Zeitpunkt der Messung

Das Ergebnisverzeichnis enthielt sowohl entpackte Dateien als auch komprimierte Archive, darunter ein 90 GB großes Sarek-Archiv und ein 43 GB großes VerifyBamID2-Archiv. Ein Teil der 401 GB bestand somit bewusst aus Duplikaten und nicht aus einzigartigen Ergebnissen.

Für eine ähnlich umfangreiche Analyse würde ich mit mindestens 1,5 TB freiem Speicherplatz beginnen. Ein Arbeitsvolume mit 2 TB bietet mehr Sicherheit, insbesondere wenn Zwischendateien, Referenzdaten, Archive und die Ergebnisse mehrerer Variant Caller erhalten bleiben sollen. Schneller lokaler SSD- oder NVMe-Speicher ist vorzuziehen, da Alignment und Variant Calling erhebliche Mengen an Lese- und Schreibzugriffen verursachen.

Der Nextflow-Koordinator selbst lief mit 16 GB Arbeitsspeicher, organisierte jedoch lediglich den Workflow. Die eigentlichen Analyse-Tasks wurden separat ausgeführt. In meiner Konfiguration forderte DeepVariant 32 GB RAM an, GATK MarkDuplicates 64 GB und Varlociraptor zunächst ebenfalls 64 GB, mit der Möglichkeit, nach einem fehlgeschlagenen Versuch mehr Speicher anzufordern.

Für eine einzelne Workstation oder einen Server wären etwa 128 GB RAM und 8 bis 16 CPU-Kerne eine komfortable Ausstattung für einen derart umfangreichen Multi-Caller-Workflow. Ein System mit 64 GB kann ebenfalls ausreichen, wenn die Anzahl gleichzeitig laufender Tasks begrenzt und einige optionale, speicherintensive Caller deaktiviert werden.

Eine geeignete Maschine muss man nicht selbst besitzen. Alternativ kann ein virtueller oder dedizierter Server gemietet werden. Ich selbst habe mit Contabo gute Erfahrungen gemacht, auch wenn dies keine gesponserte Empfehlung ist. Der kleinste Standard-VPS wäre für eine solche Analyse jedoch nicht geeignet. Entscheidend sind ausreichend Arbeitsspeicher, etwa 2 TB Arbeits-Speicherplatz und eine vernünftige Festplattenperformance.

Ein vollständiges Genom gehört zu den eindeutig identifizierbaren personenbezogenen Daten. Bei der Nutzung eines gemieteten Servers sollte der Zugriff daher eingeschränkt werden, SSH-Schlüssel sollten verwendet werden und Speicher sowie Backups sollten nach Möglichkeit verschlüsselt sein. Nicht mehr benötigte Dateien sollten gelöscht werden.

Was bedeutet eine Sequenziertiefe von 30× eigentlich?

Die Sequenziertiefe beschreibt, wie viele Reads eine bestimmte Position im Referenzgenom überlappen. Eine Tiefe von 30× bedeutet nicht, dass jede Position exakt von 30 Reads abgedeckt wird. Gemeint ist vielmehr, dass die durchschnittliche Abdeckung über das gesamte Genom ungefähr 30 Reads pro Position beträgt.

Dieser Unterschied ist wichtig. tellmeGen beschreibt sein Produkt mittlerweile als Ganzgenomsequenzierung mit einer durchschnittlichen Abdeckung von 30×. Genomische Positionen werden demnach im Mittel ungefähr 30-mal gelesen (tellmeGen, 2026).

Einige Positionen erhalten zwangsläufig mehr Reads, andere weniger. Die Verteilung wird unter anderem durch zufällige Stichprobeneffekte, den GC-Gehalt, repetitive DNA, die Eindeutigkeit einer Sequenz und die Frage beeinflusst, wie gut sich kurze Reads dem Referenzgenom zuordnen lassen.

Meine beiden FASTQ-Dateien enthielten jeweils ungefähr 360 Millionen Reads mit einer Read-Länge von 150 Basen. Zusammen waren es also ungefähr 720 Millionen einzelne Reads beziehungsweise etwa 360 Millionen Read-Paare.

Die gesamte Rohsequenzmenge betrug damit:

720 Millionen Reads × 150 Basen = 108 Milliarden Basen beziehungsweise 108 Gb

Teilt man dies durch die Größe eines haploiden menschlichen Genoms von ungefähr 3,1 bis 3,2 Milliarden Basen, ergibt sich eine theoretische Roh-Sequenziertiefe von etwa 34 bis 35×. Bereits diese einfache Berechnung deutete darauf hin, dass tellmeGen genügend Daten für ein nominelles 30×-Genom erzeugt hatte.

Die Messungen der tatsächlich verarbeiteten Daten bestätigen dies noch direkter. Die finale rekalibrierte Probe erreichte eine mediane Sequenziertiefe von 36×, während der nach Chromosomenlänge gewichtete Mittelwert über die Chromosomen 1–22 bei ungefähr 34,4× lag.

Hat tellmeGen die versprochenen 30× geliefert?

Ja.

Der geschätzte autosomale Mittelwert von ungefähr 34,4× liegt über der von tellmeGen beworbenen durchschnittlichen Sequenziertiefe von 30×. Auch die finale mediane Sequenziertiefe von 36× bestätigt unabhängig davon dasselbe Ergebnis.

Die kumulative Mosdepth-Abdeckung betrug ungefähr:

Minimale Sequenziertiefe	Anteil der Referenzpositionen
Mindestens 1×	95 %
Mindestens 5×	94 %
Mindestens 10×	94 %
Mindestens 20×	Etwa 87 %
Mindestens 30×	73 %
Mindestens 50×	2 %

Auf den ersten Blick könnte es widersprüchlich erscheinen, dass das Genom durchschnittlich mit etwa 34,4× sequenziert wurde, gleichzeitig aber nur 73 % der Referenzpositionen mindestens 30× erreichten. Das ist jedoch kein Widerspruch.

Ein Mittelwert beschreibt die gesamte Verteilung. Positionen mit einer Abdeckung oberhalb von 30× können mathematisch Positionen mit weniger als 30× ausgleichen. Selbst bei einem technisch hervorragenden Short-Read-Genom gibt es sowohl stark als auch schwach abgedeckte Regionen.

Außerdem verwendet die kumulative Prozentangabe von Mosdepth die untersuchten Referenzbasen als Nenner. Abhängig von Referenz und Analyseeinstellungen können darin auch Referenzlücken, repetitive Regionen, zentromerische Sequenzen und andere Positionen enthalten sein, die sich mit 150 Basen langen Reads nur schlecht oder gar nicht eindeutig mappen lassen. Die ungefähr 5–6 % ohne nennenswerte Abdeckung sollten daher nicht automatisch so interpretiert werden, als würden 5–6 % der biologisch relevanten oder klinisch zuverlässig auswertbaren DNA fehlen.

Eine Analyse des tatsächlich „callable“ Genoms könnte diese Frage genauer beantworten, indem ungeeignete Referenzregionen ausgeschlossen und Mindestanforderungen an Mapping-Qualität, Basenqualität und Genotypqualität gestellt werden.

Abdeckung der einzelnen Chromosomen

Die meisten Autosomen hatten eine durchschnittliche Sequenziertiefe von ungefähr 31–37×. Chromosom 22 lag mit etwa 25,4× darunter, während die Chromosomen 14 und 15 jeweils ungefähr 29,6× erreichten.

Diese Chromosomen enthalten große repetitive und schwierig zu mappende Regionen. Die niedrigeren chromosomenweiten Mittelwerte sind daher durchaus erwähnenswert, bedeuten aber nicht, dass ein komplettes Chromosom nicht funktioniert hätte. Es gab keinen Ausfall eines gesamten Chromosoms.

Bei medizinisch interessanten Varianten reicht der genomweite Mittelwert ohnehin nicht aus. Der jeweilige Locus sollte separat auf Read-Tiefe, Genotypqualität, Mapping-Qualität, Strandverteilung und lokale Mappierbarkeit untersucht werden.

Hervorragende Qualität der Rohdaten

Die Rohdaten der Sequenzierung waren von hoher Qualität:

• Read 1 hatte über die einzelnen Sequenzierzyklen hinweg mittlere Qualitätswerte von ungefähr Q35–36 und endete bei etwa Q34,8.
• Read 2 begann bei ungefähr Q36 und endete bei etwa Q34,0.
• 94,5 % aller Basen, also ungefähr 102 Gb, hatten einen Qualitätswert von mindestens Q30.
• Der Anteil nicht bestimmbarer N-Basen lag praktisch bei null.
• Es wurden keine relevanten Probleme mit Adaptern oder überrepräsentierten Sequenzen festgestellt.
• fastp behielt mit der im Bericht dargestellten Genauigkeit 100 % der Reads bei.

Eine Base mit Q30 besitzt eine geschätzte Fehlerwahrscheinlichkeit von 0,1 %, was ungefähr einem fehlerhaften Base Call auf 1.000 entspricht. Q35 steht für eine nochmals niedrigere geschätzte Fehlerwahrscheinlichkeit. Qualitätswerte oberhalb von Q30 über nahezu die gesamte Länge von 150 Basen sind daher ein sehr gutes Ergebnis.

Wie bei Illumina-Sequenzierungen üblich nahm die Qualität zum Ende von Read 2 leicht ab. Die Werte blieben jedoch auch am Ende sehr hoch. Es gibt keine Hinweise auf einen problematischen Qualitätseinbruch am Read-Ende.

Die beiden FastQC-Warnungen

FastQC kennzeichnete für beide Reads zwei Kategorien mit einer Warnung:

• Per-base sequence content
• Per-sequence GC content

Eine Warnung bedeutet nicht automatisch, dass eine Sequenzierung fehlgeschlagen ist. FastQC verwendet allgemeine statistische Erwartungen, und auch technisch einwandfreie Bibliotheken können Warnungen auslösen, wenn sie nicht perfekt zum zugrunde liegenden Modell passen.

Per-base sequence content

Während der ersten ungefähr acht Sequenzierzyklen zeigte sich ein Ungleichgewicht zwischen A, C, G und T. Nach diesen ersten Positionen stabilisierte sich die Zusammensetzung deutlich: A und T lagen jeweils bei ungefähr 30 %, G und C jeweils bei etwa 20 %.

Die FastQC-Dokumentation zum Per-base sequence content beschreibt, dass dieses Modul überprüft, ob sich die relativen Nukleotidanteile über die einzelnen Read-Positionen hinweg wie erwartet verhalten. In meiner Probe war die Abweichung im Wesentlichen auf die ersten wenigen Basen beschränkt. In Kombination mit der hervorragenden Basenqualität, der hohen Mapping-Rate und dem Fehlen von Adapter- oder überrepräsentierten Sequenzproblemen spricht dieses Muster eher für einen leichten Bias während der ersten Sequenzierzyklen beziehungsweise bei der Bibliothekspräparation als für ein grundsätzliches Sequenzierproblem.

Per-sequence GC content

Der gesamte GC-Gehalt betrug 40,3 %, wobei die Verteilung ihren höchsten Punkt bei ungefähr 38–39 % hatte. Dies passt gut zu einer menschlichen Ganzgenomsequenzierung.

Die beobachtete Verteilung wich allerdings ausreichend stark von der von FastQC modellierten Normalverteilung ab, um eine Warnung auszulösen. Es gab jedoch weder einen ausgeprägten zweiten Peak noch eine relevante Verringerung des Mappings auf das menschliche Genom oder ein Signal für überrepräsentierte Sequenzen. Die FastQC-Dokumentation zum Per-sequence GC content weist darauf hin, dass das Modul die beobachtete Verteilung mit einem theoretischen Modell vergleicht. Eine Warnung allein ist daher kein Beleg für eine Kontamination.

Ich würde beide FastQC-Befunde deshalb als kleinere Warnungen und nicht als Grund zur Sorge einstufen.

Mapping und Qualität der Sequenzierbibliothek

Nach dem Alignment wurden 99,2 % der Reads dem menschlichen Referenzgenom zugeordnet. Nur etwa 0,8 % waren vor den späteren BAM-Filterungsschritten nicht gemappt.

Das ist eine hervorragende Mapping-Rate und zeigt, dass sich die überwältigende Mehrheit der Reads wie menschliche genomische DNA verhielt. Gleichzeitig spricht dies gegen einen größeren Anteil bakterieller, aus Lebensmitteln stammender oder anderer offensichtlich nichtmenschlicher DNA in der Speichelprobe.

Der Anteil korrekt gepaarter Reads lag bei 96,1 %. Das bedeutet, dass beide Enden der meisten DNA-Fragmente in der erwarteten Orientierung und in einem plausiblen Abstand zueinander gemappt wurden. Zusammen mit einer mittleren Insert-Größe von 286 bp spricht dies für eine gut aufgebaute Short-Read-Bibliothek.

Warum unterscheiden sich die Schätzungen der Duplikationsrate?

Der Bericht enthält drei unterschiedliche Schätzungen der Duplikationsrate:

Tool	Geschätzte Duplikationsrate
FastQC	Etwa 12,1–12,2 %
fastp	4,3 %
Picard MarkDuplicates	1,1 %

Diese Werte lassen sich nicht direkt miteinander vergleichen, da die Programme unterschiedliche Algorithmen und Definitionen verwenden.

FastQC und fastp schätzen die Duplikation anhand der Read-Sequenzen, bevor deren genomische Alignment-Position berücksichtigt wird. Natürlich wiederholte Bereiche des menschlichen Genoms sowie Reads, die zufällig mit derselben Sequenz beginnen, können deshalb ebenfalls zu diesen Schätzungen beitragen.

Picard bewertet dagegen duplizierte Fragmente nach dem Alignment. Dabei werden Mapping-Positionen und Informationen über die Read-Paare verwendet, um Reads zu identifizieren, die wahrscheinlich durch PCR-Amplifikation oder optische Duplikation aus demselben ursprünglichen DNA-Molekül entstanden sind. Für das nachfolgende Variant Calling ist diese alignierungsbasierte Schätzung daher die relevanteste der drei.

Die Picard-Duplikationsrate von nur 1,1 % ist hervorragend. Sie spricht dafür, dass die große Menge sequenzierter Daten aus einer sehr vielfältigen Sammlung ursprünglicher DNA-Fragmente stammt und nicht lediglich aus der wiederholten Sequenzierung einer kleinen Bibliothek.

Hat die Speichelprobe zu Kontaminationen geführt?

Speichelproben können bakterielle DNA, DNA aus Nahrungsbestandteilen und DNA anderer nichtmenschlicher Quellen enthalten. In meinen Daten gibt es jedoch keinen offensichtlichen Hinweis darauf, dass solches Material die Sequenzierung relevant beeinträchtigt hätte:

• 99,2 % der Reads wurden dem menschlichen Referenzgenom zugeordnet.
• Der GC-Gehalt war für menschliche WGS-Daten passend.
• Es gab keinen ausgeprägten ungewöhnlichen zweiten GC-Peak.
• Es wurde kein relevantes Problem mit überrepräsentierten Sequenzen festgestellt.

Diese Beobachtungen sprechen deutlich dafür, dass nichtmenschliche DNA keinen wesentlichen Anteil der Bibliothek ausmachte. Sie stellen allerdings keine formale taxonomische Analyse der nicht gemappten Reads dar.

Auch eine Kontamination mit DNA einer anderen Person lässt sich allein anhand der Mapping-Statistiken nicht erkennen. Reads einer anderen Person würden sich schließlich ebenfalls gut an das menschliche Referenzgenom alignieren lassen. Deshalb habe ich zusätzlich VerifyBamID2 verwendet. Dieses Tool schätzt eine Kontamination mit DNA anderer Menschen anhand von Allelmustern und berücksichtigt dabei die genetische Abstammung (Zhang, Genome Research, 2020).

Das wichtigste Ergebnis war:

FREEMIX = 0.000161754

Als Prozentwert entspricht dies:

0,000161754 × 100 = 0,0162 %

Für praktische Zwecke der Qualitätskontrolle ist dieser Wert im Grunde null. Ich fand keinen relevanten Hinweis darauf, dass die Probe DNA einer anderen Person enthielt.

VerifyBamID2 gab außerdem Hauptkomponenten-Koordinaten für eine „intended sample“ und eine hypothetische „contaminating sample“ aus. Diese Koordinaten beschreiben Positionen in einem abstammungsbezogenen statistischen Raum. Es handelt sich nicht um Kontaminationswerte. Da der geschätzte Anteil einer möglichen Verunreinigung praktisch null beträgt, sollten die Koordinaten der hypothetischen Kontaminationsprobe nicht als Hinweis darauf interpretiert werden, dass tatsächlich eine zweite Person in der Probe vorhanden war.

Eine Einschränkung: regionale Gleichmäßigkeit der Abdeckung

Die indexcov-Zusammenfassung ergab ungefähr:

• 6,6 % der Bins mit einer normalisierten Sequenziertiefe unter 0,15
• 15,3 % der Bins außerhalb des normalisierten Bereichs von 0,85–1,15

Indexcov schätzt die Abdeckung in großen genomischen Bins und dient dazu, fehlende Regionen, großflächige Unterschiede der Abdeckung, Aneuploidien sowie größere Deletionen oder Duplikationen sichtbar zu machen (Pedersen, GigaScience, 2017).

Der Anteil der Bins mit sehr geringer Abdeckung passt in etwa zu den schwierigen beziehungsweise nicht abgedeckten Teilen der Referenz, die auch bei Mosdepth sichtbar wurden. Der Anteil außerhalb des Bereichs deutet darüber hinaus auf eine gewisse regionale Variation der Sequenziertiefe hin. Da dieser Bericht nur eine einzige Probe umfasst, steht allerdings keine Sequenzierkohorte zum direkten Vergleich zur Verfügung.

Ich halte diesen Punkt insbesondere für Copy-Number- und Strukturvariantenanalysen für erwähnenswert, aber nicht für ein offensichtliches Warnsignal. Die allgemeinen Mapping-, Sequenziertiefen-, Pairing-, Basenqualitäts- und Duplikationsmetriken sind sehr gut, und es gibt keinen Ausfall eines vollständigen Chromosoms.

Was dieser Qualitätsbericht nicht garantieren kann

Ein guter genomweiter Qualitätsbericht bedeutet nicht, dass jedes einzelne Ergebnis automatisch korrekt ist.

Short Reads sind weiterhin weniger zuverlässig in repetitiven Sequenzen, segmentalen Duplikationen, Pseudogenen und Genen mit sehr ähnlichen Kopien. Benchmarking-Arbeiten des Genome in a Bottle Consortium haben gezeigt, dass Hunderte medizinisch relevanter Gene Regionen enthalten, die mit klassischen Short-Read-Methoden nur schwer zuverlässig untersucht werden können (Wagner, Nature Biotechnology, 2022).

Bei einer einzelnen Variante würde ich deshalb weiterhin folgende Punkte prüfen:

• lokale Sequenziertiefe,
• Genotypqualität,
• Mapping-Qualität,
• Allelverhältnis und Strandverteilung,
• nahe gelegene repetitive Sequenzen oder duplizierte Gene,
• Übereinstimmung zwischen verschiedenen Variant Callern
• sowie externe Populations- und klinische Datenbanken.

Um die Identität der Probe zweifelsfrei nachzuweisen, wäre außerdem ein separater genetischer Fingerprint oder der Vergleich mit einer unabhängig gewonnenen Probe erforderlich. VerifyBamID2 zeigt, dass die Daten nicht wie eine Mischung verschiedener Personen aussehen. Ohne einen Referenzgenotyp kann das Tool jedoch nicht beweisen, dass die Probe tatsächlich zu einer bestimmten namentlich bekannten Person gehört.

Die Ergebnisse sollten zudem nicht mit einem validierten klinisch-diagnostischen Test gleichgesetzt werden. Medizinisch relevante Befunde sollten sorgfältig überprüft und gegebenenfalls durch ein akkreditiertes diagnostisches Labor bestätigt werden.

Fazit

Die Sequenzierung von tellmeGen scheint eine tatsächlich hochwertige menschliche Ganzgenomsequenzierung mit ungefähr 34–36× Sequenziertiefe zu sein.

Die wichtigsten Ergebnisse sind:

• kein relevantes Problem mit der Basenqualität,
• eine ausreichende Menge an Rohdaten,
• 94,5 % der Basen mit Q30 oder besser,
• 99,2 % Mapping auf das menschliche Referenzgenom,
• sehr gutes Verhalten der gepaarten Reads,
• eine außergewöhnlich niedrige alignierungsbasierte Duplikationsrate,
• kein offensichtlicher Hinweis auf eine relevante nichtmenschliche Kontamination,
• eine praktisch bei null liegende geschätzte Kontamination durch eine andere menschliche Probe
• und eine durchschnittliche Sequenziertiefe deutlich oberhalb der beworbenen 30×.

Die entscheidende Einschränkung besteht darin, dass eine durchschnittliche Sequenziertiefe von 30× nicht bedeutet, dass jede genomische Position 30-mal sequenziert wurde. Rund 73 % der vollständig untersuchten Referenz erreichten mindestens 30×, während schwierige, repetitive und schlecht mappbare Regionen eine geringere Abdeckung aufwiesen. Das ist für eine Short-Read-Ganzgenomsequenzierung zu erwarten und steht nicht im Widerspruch zum geschätzten autosomalen Mittelwert von 34,4×.

Es gibt somit kein allgemeines Qualitätsproblem, das gegen weitere Analysen sprechen würde. Bei medizinisch interessanten Varianten bleiben die regionsspezifische Sequenziertiefe, die Genotypqualität und die Mappierbarkeit jedoch entscheidend.

Als Nächstes möchte ich polygenetische Scores mithilfe des Polygenic Score Catalog berechnen. Der Katalog stellt publizierte Score-Definitionen mit den dazugehörigen Varianten, Allelen, Gewichtungen und kuratierten Metadaten bereit, die für eine reproduzierbare Anwendung benötigt werden (Lambert, Nature Genetics, 2021). Der PGS Catalog Calculator unterstützt eine reproduzierbare Berechnung solcher Scores sowie eine abstammungsbezogene Normalisierung (Lambert, Nature Genetics, 2024).

Ein polygenetischer Score ist keine Diagnose. Er fasst eine genetische Prädisposition im Verhältnis zu einer geeigneten Referenzpopulation zusammen. Seine Interpretation hängt unter anderem von der genetischen Abstammung, der Kalibrierung, der zugrunde liegenden Studie und davon ab, welchen Anteil eines Merkmals der jeweilige Score überhaupt vorhersagen kann. Dennoch wird die Berechnung solcher Scores anhand meiner eigenen Ganzgenomdaten ein interessanter nächster Schritt sein, um weiter zu untersuchen, was persönliche Genomdaten über einen selbst aussagen können – und was nicht.